ISBN: 978-84-1142-022-8

Resumen

El cáncer es la segunda causa de morbilidad y mortalidad del mundo después de los accidentes cardiovasculares. Los más frecuentes son los carcinomas, originados por transformaciones en células epiteliales. Durante el proceso de Transición Epitelio-Mesénquima (TEM) las células epiteliales pierden su fenotipo epitelial (polaridad, contactos célula-célula y contactos célula- matriz) y adquieren un fenotipo mesenquimal, de manera que se pierde la integridad y la homeostasis del tejido y las células adquieren capacidades migratorias e invasivas. Durante el proceso de TEM aumenta los niveles de E3 ubiquitin-ligasa Hakai y como consecuencia se produce una mayor degradación de E-cadherina, de manera que se alteran las uniones entre células epiteliales y se pierde el fenotipo epitelial normal. Sin embargo, los cambios producidos por la acción de Hakai no sólo pueden ser atribuidos a la pérdida de E-cadherina.

Fueron estudiadas tres líneas celulares: células epiteliales normales MDCK, y las líneas HA-4 y HA-7 que sobreexpresan Hakai de forma estable. Mediante microscopía de contraste de fases se observó el fenotipo epitelial normal que presentan las células MDCK y cómo las líneas HA-4 y HA-7 adquieren un fenotipo mesenquimal perdiendo los contactos celulares y adquiriendo proyecciones celulares características de la transición hacia el fenotipo mesenquimal.

Se llevó a cabo un estudio proteómico cuyos resultados señalan 102 proteínas que son up- reguladas por Hakai. Fueron analizadas las funciones celulares de dichas proteínas así como su presencia o no en exosomas, con el objetivo de seleccionar aquellas con una posible relación en la TEM. Los niveles de expresión de las proteínas HSP-70, HSP-90, Vimentina y CK-18 fueron validados mediante western-blotting, comparando su expresión en las tres líneas celulares estudiadas. Los resultados obtenidos para HSP-70 y Vimentina no han sido concluyentes, de manera que sería necesario repetir el experimento. En el caso de la CK-18, no se detectaron niveles de expresión en ninguna de las líneas celulares sujeto de estudio. Por su parte, los niveles de HSP-90 aumentaron en las líneas HA-4 y HA-7 respecto a las MDCK.

Introducción

Cáncer

El cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, siendo la segunda causa de muerte después de las enfermedades cardiovasculares. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) de las 56 millones de muertes que se produjeron en el año 2000, el 12% fueron causadas por tumores malignos y se prevé que en los próximos 20 años el número de nuevos casos aumente aproximadamente un 70%. Esto es debido fundamentalmente al envejecimiento de la población y la tendencia a hábitos de vida insanos (tabaquismo, mala alimentación, etc). En el año 2012 los cánceres diagnosticados con más frecuencia fueron los de pulmón, próstata, colon, recto, estómago e hígado en el hombre y mama, colon, recto, pulmón, cuello uterino y estómago en mujeres. La mayoría de los tumores humanos comunes son carcinomas, originados en las células epiteliales.

En el año 2000 Douglas Hanahan y Robert A.Weinberg describieron una serie de capacidades distintivas y complementarias que permiten el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. Se trata de 6 características:

– Mantenimiento de las señales proliferativas: las células cancerosas son autosuficientes en lo que a señales de crecimiento se refiere, generando sus propias señales mitogénicas.

– Evasión de supresores de crecimiento: las células cancerosas son capaces de evadir este tipo de señales y continuar proliferando.

– Resistencia a la muerte celular: las células cancerosas son capaces de resistir la apoptosis por distintos mecanismos, siendo el más frecuente el que implica mutación en el gen supresor de tumores p53, lo que supone la pérdida de un regulador proapoptótico importante.

– Inmortalidad replicativa: las células cancerosas tiene un potencial de replicación ilimitado a diferencia de las células normales, las cuales sólo son capaces de dividirse un número de veces limitado hasta entrar en senescencia.

– Inducción a la angiogénesis: es imprescindible para la supervivencia de las células el aporte de oxígeno y nutrientes de manera que las células cancerosas ha de poseer la capacidad de desarrollar nuevos vasos sanguíneos en su entorno.

– Activación de la invasión y la metástasis: las células tumorales pueden invadir tejidos adyacentes y recorrer largas distancias a través de los vasos sanguíneos y colonizar otros tejidos.

Recientemente han sido descritas dos características diferenciales más. Por un lado se ha observado un cambio en el metabolismo energético de las células tumorales respecto a las células normales. En segundo lugar parece que las células cancerosas son capaces de limitar la capacidad del sistema inmune para erradicarlas. De este modo las células tumorales evaden el reconocimiento y eliminación que debe llevar a cabo el sistema inmune sobre las células de cáncer incipiente.

Índice

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

1.1. CÁNCER

1.2. CÁNCER EPITELIAL

1.3. UNIONES CÉLULA-CÉLULA

1.4. TRANSICIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA (TEM) Y PAPEL DE HAKAI

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. CULTIVO DE LÍNEAS CELULARES

3.2. MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES

3.3. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS, CUANTIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA WESTERN BLOT

3.4. WESTERN BLOT

3.4.1. ELECTROFORESIS SDS-PAGE

3.4.2. TRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A LA MEMBRANA DE INMUNODETECCIÓN

3.4.3. INMUNODETECCIÓN

3.4.4. ESCANEADO DE GELES Y DENSITOMETRÍA

RESULTADOS

4.1. ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS MEDIANTE ANÁLISIS PROTEÓMICO

4.2. ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS FENOTÍPICOS EN LAS LÍNEAS CELULARES DE ESTUDIO MEDIANTES MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES

4.3. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE LAS PROTEÍNAS CUANTIFICADAS Y SELECCIONADAS A ESTUDIO

DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS
BIBLIOGRAFÍA