ISBN 978-84-18991-60-8

PRÁCTICA Nº1

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBO

MEDIO DE HUGH Y LEIFFSON (150ml)

FECHA DE REALIZACIÓN: 17/12/15 FUNDAMENTO
Este medio se utiliza para realizar la prueba óxido fermentativa de Hugh y Leiffson, con la que se puede observar el metabolismo oxidativo-fermentativo de los microorganismos. Es semisólido y sus componentes, por cada litro de medio preparado, son los siguientes:
 Digerido pancreático de caseína (2g), que aportará los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo.
 Cloruro de sodio (5g), que sirve para mantener la homeostasis del medio.
 Fosfato dipotásico (0,3g), donde se encuentra la fuente de fósforo.
 Azul de bromotimol (0,08g), es el indicador de Ph que hará viraje a color amarillo cuando se produzca acidificación del medio.
El hidrato de carbono se añade a parte (en este caso utilizaremos glucosa en proporción del 1%).

MATERIALES Y APARATOS

• Papel de filtro
• Rotulador permanente
• Probeta de 250 ml
• Vaso de precipitado
• Cucharilla espátula
• Matraz Erlenmeyer de 250 ml
• Trípode y rejilla
• Varilla agitadora
• Tubos de ensayo y tapones
• Gradilla
• Pipeta graduada de 5ml
• Pipeta Pasteur
• Papel de aluminio
• Balleta
• Mechero Bunsen
• Autoclave
• Balanza

REACTIVOS

• Agua destilada
• Medio básico deshidratado de Hugh y Leiffson de la casa comercial BD
• Aceite de vaselina
• Hidrato de carbono glucosa

TÉCNICA

1. Preparamos la mesa de trabajo poniendo un papel de filtro y sobre éste el resto de materiales que utilizaremos.

2. Medimos 150 ml de agua destilada (volumen aproximado) con una probeta de 250ml.

3. Para pesar el medio hay que tener en cuenta que por cada litro de agua destilada hay que añadir 9,5g de medio en polvo. Nosotros vamos a preparar 150 ml por lo que serán necesarios 1,41g.
En cuanto al hidrato de carbono (glucosa) en proporción al 1%:

100ml medio 1g glucosa
150ml medio Xg glucosa

X= 1,5g de glucosa se pesarán para añadir a 150ml de medio Hugh y Leiffson

Una vez pasados los dos ingredientes los mezclamos y los echamos al matraz Erlenmeyer junto con el agua destilada y mezclamos con la varilla.

4. Encendemos el mechero y ponemos el matraz a calentar sobe la rejilla y el trípode, llevándolo a ebullición durante un minuto y removiendo constantemente hasta su completa disolución. Apagamos el mechero.

5. Vertemos (con una pipeta graduada) de 4 a 5 ml de medio en cada uno de los tubos de ensayo, que habremos dispuesto anteriormente en una gradilla. Añadimos a cada tubo 1ml de aceite de vaselina con la pipeta Pasteur.

6. Tapamos con un tapón y ponemos un trozo de papel de aluminio alrededor del mismo. Rotulamos los tubos con el nombre del medio y la fecha de preparación.

7. Los llevamos al autoclave para esterilizar durante 15 minutos a 121ºC.

8. Tras la esterilización comprobamos si los tubos siguen bien rotulados y los dejamos enfriar, en posición vertical, antes de meterlos en el frigorífico cubiertos con un papel de aluminio en el que habremos anotado nuevamente el nombre del medio y la fecha de preparación.

9. Uno de los tubos se meterá en la estufa como control para asegurarnos de que el procedimiento de esterilización ha sido correcto, pasadas 24 comprobaremos que no haya habido crecimiento bacteriano. En el caso de que lo hubiera se deberán desechar todos los tubos que se prepararon a la vez.

Índice

PRÁCTICA Nº1: Preparación de medios de cultivo en tubo.

Medio de Hugh y Leiffson.

PRÁCTICA Nº2: Prueba de oxidación-fermentación. Prueba óxido fermentativa de Hugh y Leiffson

PRÁCTICA Nº3: Prueba de screening de producción de ácido y gas.

PRÁCTICA Nº4: Prueba de la B-D-Galactosidasa (ONPG).

PRÁCTICA Nº5: Preparación de medios de cultivo de tubo. Medio base Moeller Descarboxilasa

PRÁCTICA Nº6: Prueba de las descarboxilasas

PRÁCTICA Nº7: Hidrólisis de gelatina por la técnica de siembra en picadura

PRÁCTICA Nº8: Preparación de medios de cultivo en tubo. Medio Agar-Hierro-Kligler.

PRÁCTICA Nº9: Prueba Agar-Hierro-Kligler AHK O KID.

PRÁCTICA Nº10: Prueba del citrato con medio Simmons.

PRÁCTICA Nº11: Prueba del citrato con medio Kosser.

PRÁCTICA Nº12: Prueba del rojo de metilo.

PRÁCTICA Nº13: Preparación de medios de cultivo en tubo. Medio Moeller Descarboxilasa-Arginina

PRÁCTICA Nº14: Hidrólisis de gelatina por la técnica de siembra en picadura sobre el microorganismo nº9.

PRÁCTICA Nº15: Prueba de oxidación-fermentación. Prueba óxido fermentativa de Hugh y Leiffson sobre el microorganismo nº12

PRÁCTICA Nº16: Prueba del indol

PRÁCTICA Nº17: Prueba de Voges Proskauer.

PRÁCTICA Nº18: Preparación de medios de cultivo en placa. Medio Agar DNA

PRÁCTICA Nº19: Resiembra de los microorganismos nº1 y nº9 en medio Agar Sangre en placa.

PRÁCTICA Nº20: Prueba de la Oxidasa.

PRÁCTICA Nº21: Prueba de la Catalasa.

PRÁCTICA Nº:22: Prueba de la Nitratasa o Nitrato Reductasa

PRÁCTICA Nº23: Prueba de la Fenilalanina Desaminasa

PRÁCTICA Nº 24: Prueba de la DNasa sobre los microorganismos nº4 y nº9.

PRÁCTICA Nº25: Preparación de medios de cultivo en placa. Medio MacConckey.

PRÁCTICA Nº26: Prueba de la Coagulasa sobre los microorganismos nº4 y nº9.

PRÁCTICA Nº27: Urocultivo en placa de Petri.

PRÁCTICA Nº28: Antibiograma.